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精密烘箱-壳聚糖絮凝澄清技术
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更新日期:2009-9-10  点击:   [ 关 闭 ]

    摘要:目的:研究壳聚糖絮凝剂对于产妇康口服液水提部位黄芪甲苷和多糖的影响。方法:经预实验确定澄清剂,以黄芪甲苷、多糖为指标,采用正交实验对壳聚糖絮凝条件进行优化。结果:壳聚糖加入量5%,药液相对密度1.07 g·ml-1,药液pH值4.5时絮凝效果最好。结论:壳聚糖絮凝法澄清效果好,经济实用,可用于产妇康颗粒水提部位的澄清。
关键词:产妇康;壳聚糖;黄芪甲苷;粗多糖;高效液相色谱
产妇康口服液主要由黄芪、益母草、当归、川芎等药材组成,主要用于产后康复,治疗产后妇女恶漏不尽,补气养血,活血祛淤,促进子宫收缩,利于产后恢复。工艺中水提部位所含的黄芪甲苷和多糖具有明显的生理活性,如果采用传统的醇沉除杂,会降低多糖等有效成分的含量,且醇沉法耗醇量大,成本高〔1〕。我们采用壳聚糖絮凝沉降法对水提液进行澄清,并选出最佳除杂工艺〔2〕。
1实验器材
高效液相色谱仪(岛津10AT-VP),HW-2000色谱工作站,SEDEX75型蒸发光散射检测器,超声清洗器〔33KHZ±2HZ,(250±70)W,上海船舶电子设备研究所〕。黄芪甲苷对照品(供定量用)由中国药品生物制品检验所提供,甲醇为色谱纯,水为重蒸水,其余试剂均为分析纯,供试样品由湖北省中药现代化工程技术研究中心提供。
2方法与结果
2.1黄芪甲苷含量测定方法〔3〕
2.1.1色谱条件与系统适用性实验十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,Eclipse XDB-C18(4.6 mm×25 cm)色谱柱,甲醇水(80∶20)为流动相,流速1 ml·min-1,ELSD漂移管温度35℃,载气(N2)流速 3.5bar。
2.1.2对照品溶液的制备精密烘箱称取黄芪甲苷对照品加甲醇溶解,使成0.168 mg·ml-1的溶液。
2.1.3供试品溶液的制备精密烘箱称取相当于1 g黄芪的稠膏,加入2%氢氧化钾甲醇50 ml,超声提取30 min,放冷滤过,移取续滤液25 ml,蒸干,残渣加水20 ml,转移至分液漏斗,水层用氯仿正丁醇(2∶1)振摇提取5次,10 ml/次。合并氯仿正丁醇(2∶1)提取液,用氨试液提取2次,25 ml/次。弃去氨试液,取氯仿正丁醇(2∶1)液置水浴上蒸干,残渣加氯仿无水乙醇(3∶1)5 ml分次转溶到硅胶柱(内径1 cm,长10 cm,干法装柱)上,以氯仿无水乙醇(3∶1)洗脱至洗脱液近无色(约15 ml),弃去洗脱液,续用无水乙醇40 ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,用甲醇溶解并转移至5 ml量瓶内,加甲醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液。
2.1.4绘制标准曲线称取黄芪甲苷对照品加甲醇溶解,使成0.168 mg·ml-1的溶液,作为对照品溶液。分别取2,4,6,8,10,12 μl注入高效液相色谱仪,以进样量和峰面积的对数进行回归计算,计算标准曲线的回归方程为lgA=1.629 lgM 5.266 1,r=0.999 4。结果表明在0.336~2.016 μg范围内,黄芪甲苷峰面积值的对数A与进样量M的对数有良好的线性关系。
2.1.5度实验吸取对照品溶液,进样5次,6 μl/次,峰面积平均值为200 612,RSD为1.4%。
2.1.6重现性实验取同一批样品,制备五份供试品溶液,进样。样品含量平均值为0.120 2 mg·g-1,RSD为1.5%。
2.1.7稳定性实验取同一样品供试液,分别于0,2,4,6,8,12,24 h进样,峰面积平均值为174 691,RSD为1.4%,说明黄芪甲苷在24 h内稳定。
2.1.8加样回收实验取已知含量的样品约4.0 g,共6份,称定,分别加入不同量的对照品溶液,挥干甲醇,照供试品溶液制备供试样,进样,测定峰面积,计算回收率为97.13%,RSD为1.4%。
2.1.9样品的测定分别吸取对照品溶液4 μl与8 μl,供试品溶液10 μl,注入液相色谱仪,测定,取峰面积的对数,用外标两点法计算,即得。见图1。
图1黄芪甲苷测定HPLC-ELSD色谱图(略)
2.2粗多糖的含量测定精称样品1.0 g稠膏,置100 ml烧杯中,加入蒸馏水50 ml,搅拌30 min,静置,滤过。精取续滤液20 ml,置100 ml锥形瓶中,加入Ca(OH)2溶液40 ml,水浴加热30 min,待沉淀完全,拿出放冷,离心。弃去上清液,残渣加水10 ml洗涤,离心,弃去洗涤液,残渣加水3 ml搅匀,滴加草酸铵试液,边加边搅拌,至沉淀不再生成,离心,上清液置已恒重的蒸发皿中,残渣加水5 ml洗涤1次,洗涤液并入蒸发皿中挥干,置烘箱中,于105℃干燥5 h,称重,计算粗多糖的含量。
2.3澄清剂的优选
2.3.1壳聚糖溶液的配制称取壳聚糖1 g加1%醋酸溶液制成1%的壳聚糖溶液。
2.3.2供试液的制备按处方称取药材总量425 g,照优选的提取工艺煎煮,过滤,同法制备9份,分别照正交表实验条件安排实验,离心,将滤液浓缩成稠膏,照上述方法测定黄芪甲苷和多糖的总量。
2.3.3壳聚糖澄清工艺正交实验选择壳聚糖加入量,药液pH值,相对沉降密度三个因素为考察对象,选用L9(34)正交表安排实验,对澄清工艺进行考察,因素水平见表1。
表1澄清工艺的因素与水平(略)
根据因素水平表,我们选择了L9(34)正交表,照上述供试液制备方法制备样品,测定其黄芪甲苷和多糖总含量为检测指标。数据见表2。
表2澄清工艺的正交实验数据(略)
由上表的直观分析可以看出影响黄芪和多糖量的实验因素都为A>C>B。为了进一步估计实验中所存在的误差大小,我们作了实验结果的方差分析。结果见表3~4。
由方差分析可知,以黄芪甲苷为考察指标,各因素作用主次为A>C>B,A、C有显著性影响,以A1B2C2为最佳;以多糖为指标,各因素作用主次为A>C>B,A、C有显著性影响,以A1B2C1为最佳工艺。综合考虑,由于黄芪为方中主要的药味,且黄芪甲苷为主要的有效成分,因此将黄芪甲苷作为主要考察指标,优选A1B2C2为最佳条件,即5%的壳聚糖,药液pH值为4.5,密度为1.07 g·ml-1时加入。
验证实验:取同样处方量,按照正交实验优选的最加工艺条件,重复3次实验,测得多糖和黄芪甲苷含量数据见表5。
表3水提液中黄芪甲苷的方差分析(略)
表4多糖总量的方差分析(略)
表5验证实验结果mg实验(略)
3讨论
3.1壳聚糖沉降法能较大程度的保留产妇康水提液中黄芪甲苷和多糖等有效成分的含量,且用量少,成本低。
3.2壳聚糖是含氨基基团的高分子长链化合物。在酸性条件下,可很好的伸展其长链,成为阳离子型絮凝剂,同时发挥吸附架桥和电中和作用,以达到澄清的目的。本药液pH值为4.5,符合沉降条件。药液浓缩密度和壳聚糖用量大对黄芪甲苷和多糖量的都有影响。
3.3实验证明,含有黄芪甲苷的样品经硅胶柱处理后,能完全消除杂质峰的干扰,基线非常平稳,且回收率较好。用蒸发光散射检测器测定黄芪甲苷的含量,分离度好,灵敏度较高,重现性好.



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